INVISIBLE SENTINEL đã phát triển một công nghệ phân tử mới được gọi là VERIFLOW, kiểm soát vi sinh vật cho ngành bia bằng phương pháp PCR, giúp cải thiện triệt để các vấn đề hạn chế như chi phí cao, độ nhạy và độ chính xác thấp. VERIFLOW cũng được thiết kế với một bộ tính năng toàn diện để đáp ứng nhu cầu đa dạng của người dùng cuối trong nhiều ngành công nghiệp. Công nghệ này sử dụng các nguyên tắc khoa học đã được chứng minh để phát hiện vi khuẩn kết hợp với các phương pháp khoa học độc quyền mới để đạt được hiệu suất tối ưu. Kết quả là một nền tảng công nghệ DNA Signature Capturing – một phương pháp mới để khuếch đại và nhận dạng DNA kết hợp với quy trình làm việc đơn giản, không bị cản trở từ việc thu thập mẫu đến giải thích dữ liệu. VERIFLOW đã được áp dụng trên nhiều ngành công nghiệp bao gồm an toàn thực phẩm và chất lượng đồ uống, tập trung vào ngành sản xuất bia. Kể từ khi ra mắt BREWPAL® vào tháng 4 năm 2015, INVISIBLE SENTINEL đã hợp tác với các nhà máy bia hàng đầu trên toàn thế giới để giải quyết các mối lo ngại về chất lượng vi sinh vật của họ. Hàng trăm nhà máy bia tại hơn 15 quốc gia hiện đang sử dụng công nghệ VERIFLOW để bảo vệ thương hiệu của mình và đảm bảo bia đáp ứng các tiêu chuẩn chất lượng nghiêm ngặt nhất.

TỔNG QUAN VỀ CÔNG NGHỆ VERIFLOW

Kết hợp các phương pháp khoa học mới, VERIFLOW® kết hợp công nghệ PCR điểm cuối mạnh mẽ với khả năng phát hiện dựa trên dòng chảy bia.

Quá trình này bắt đầu bằng việc khuếch đại DNA mục tiêu, một bước thiết yếu trong chẩn đoán phân tử dựa trên PCR. Khuếch đại là quá trình tăng số lượng bản sao của một chuỗi DNA cụ thể đến mức có thể phát hiện được. Có một số công nghệ khuếch đại khác nhau, tuy nhiên VERIFLOW sử dụng cách tiếp cận độc quyền, độc đáo. Các enzyme độc quyền được VERIFLOW sử dụng trong quá trình khuếch đại được thiết kế mạnh mẽ và có khả năng chống lại sự ức chế. Điều này cho phép quá trình khuếch đại diễn ra mà không bị ảnh hưởng bởi các chất ức chế hiện diện tự nhiên trong nhiều mẫu khác nhau. Các phương pháp truyền thống yêu cầu tinh chế mẫu nghiêm ngặt để loại bỏ các chất ức chế và đảm bảo khuếch đại thành công. Công nghệ cô lập enzyme và chất ức chế độc quyền của VERIFLOW loại bỏ nhu cầu tinh chế mẫu hoặc tách chiết DNA, nhờ đó giảm đáng kể độ phức tạp của quy trình xét nghiệm tổng thể. Sự cải thiện về quy trình làm việc và tính mạnh mẽ này cho phép một số lợi ích sẽ được thảo luận sâu hơn trong bài viết này.

Bước tiếp theo trong quy trình phát hiện là phát hiện DNA mục tiêu được khuếch đại từ mẫu một cách hợp lý. Không giống như các phương pháp dựa trên PCR thời gian thực (RT) truyền thống, VERIFLOW không sử dụng phương pháp phát hiện quang học DNA khuếch đại. Phát hiện quang học có một số nhược điểm bao gồm yêu cầu “làm sạch” mẫu để tránh nhiễu với cảm biến quang. Thay vào đó, việc sử dụng hệ thống phát hiện dấu hiệu DNA duy nhất cho phép VERIFLOW thu thập DNA khuếch đại trên một cassette cầm tay. DNA mục tiêu liên kết với vạch thử nghiệm trên cassette để cho phép giải thích kết quả dễ dàng.

Tiến bộ quan trọng cuối cùng trong quá trình phát triển VERIFLOW là giải quyết khả năng DNA di chuyển qua một tập hợp mao mạch để đạt được khả năng phát hiện cuối cùng và hiển thị kết quả trong một cassette cầm tay. VERIFLOW đã phát triển một phương pháp tiếp cận dòng chảy thẳng đứng mạnh mẽ và khả thi. Cách tiếp cận này, kết hợp với những sửa đổi về cả vật lý và vật liệu điều hòa dòng chảy, cho phép DNA nguyên vẹn đi đến vạch thử nghiệm cuối cùng một cách thành công. Tính năng này của công nghệ dòng chảy dọc cho kết quả tức thì và giảm đáng kể dòng chảy ngược, hai hạn chế liên quan đến công nghệ dòng chảy ngang, một loại công nghệ chẩn đoán nhanh thay thế. Kết quả VERIFLOW là kết quả định tính và định lượng bằng cách sử dụng Đầu đọc quang học cho phép phát hiện và liệt kê để đánh giá rủi ro vi sinh vật.

ÁP DỤNG KHOA HỌC VÀO CÔNG NGHỆ

Phương pháp không cần chiết xuất DNA

Trước đây, các phương pháp phân tử đã cải thiện đáng kể độ đặc hiệu và độ nhạy nhưng chi phí cao và khi thực hiện cần yêu cầu thiết bị chuyên dụng cũng như nhân viên được đào tạo chuyên sâu. Một số yếu tố góp phần dẫn đến chi phí cao là nhu cầu chuẩn bị mẫu phức tạp trước khi khuếch đại PCR, sau đó là phát hiện quang học các sản phẩm bằng thiết bị chi phí cao . Phương pháp dựa trên RT-PCR đòi hỏi các bước tách chiết DNA phức tạp do có chất ức chế trong bia. Sự ức chế PCR có thể được gây ra bởi sự bất hoạt của enzyme và/hoặc các tương tác không đặc hiệu giữa mồi và DNA mục tiêu. Trong các phương pháp này, việc không sử dụng mẫu DNA có độ tinh khiết cao có thể làm tăng khả năng xảy ra kết quả dương tính giả và âm tính giả. VERIFLOW® được thiết kế để đáp ứng những thách thức này. Công nghệ này sử dụng phương pháp không cần chiết DNA giúp giảm đáng kể thời gian chuyển mẫu từ túi tăng sinh sang ống PCR. Công nghệ đệm mạnh mẽ kết hợp với DNA polymerase kháng chất ức chế không chỉ mang lại độ ổn định và độ nhạy vượt trội mà còn cho phép khuếch đại hiệu quả các mục tiêu DNA trực tiếp từ các mẫu thực phẩm thô, do đó loại bỏ nhu cầu tinh chế DNA. Hiệu suất của các biến thể enzyme này được nâng cao hơn nữa bằng cách sử dụng các chiến lược xử lý mẫu mới giúp đơn giản hóa, đẩy nhanh và giảm chi phí so với các xét nghiệm dựa trên PCR phức tạp. Việc loại bỏ quá trình tinh chế mẫu giúp giảm đáng kể nhiều thao tác mẫu, do đó giảm nguy cơ lỗi do người dùng. Phản ứng PCR VERIFLOW được bảo vệ hơn nữa khỏi khả năng lây nhiễm bằng cách thay thế dTTP (deoxythymidine triphosphate) bằng dUTP (deoxyuridine triphosphate) trong hỗn hợp dNTP (deoxynucleotide) cùng với Uracil-DNA Glycosylase (UDG). Trước khi bắt đầu PCR, hoạt động UDG sẽ tách bazơ uracil trong DNA chứa dUTP (khuếch đại) ngăn chặn quá trình tái khuếch đại do nhiễm bẩn.

Khuếch đại DNA

PCR là một kỹ thuật tại chỗ cho phép nhân một chuỗi DNA cụ thể trong một mẫu. Do độ nhạy và độ đặc hiệu cao, PCR đã trở thành một kỹ thuật phổ biến trong lĩnh vực công nghệ sinh học và chẩn đoán. Quá trình này sử dụng các oligonucleotide bổ sung (mồi) để nhận biết cụ thể trình tự di truyền duy nhất trong bộ gen của mầm bệnh mục tiêu. Đoạn DNA cụ thể này trải qua quá trình làm nóng và làm mát ba bước theo chu kỳ, còn được gọi là chu trình nhiệt, trong ống thuốc thử PCR chứa hỗn hợp tổng thể gồm DNA polymerase, nucleotide và mồi. Đối với dòng thử nghiệm VERIFLOW, quy trình này được thực hiện trong Máy điều nhiệt VERIPRO.

Ba chu kỳ PCR:

Biến tính

DNA mục tiêu sợi đôi được biến tính ở nhiệt độ cao thành hai sợi đơn riêng biệt

Ủ lớp lót

Nhiệt độ được hạ xuống để cho phép hai oligonucleotide tổng hợp (hoặc mồi) được đánh dấu trước lai với DNA mục tiêu.

Phần mở rộng

Nhiệt độ được tăng lên để kích hoạt quá trình trùng hợp, trong đó phân tử DNA sợi đôi mới được đánh dấu (khuếch đại) được tạo ra bằng cách mở rộng các đoạn mồi bổ sung cho mẫu DNA sợi đơn

Ba bước này được lặp lại hơn 30 lần (tùy thuộc vào mục tiêu quan tâm), dẫn đến sự khuếch đại theo cấp số nhân của DNA mục tiêu

Trực quan hóa kết quả

Một trong những yếu tố thách thức nhất trong việc đáp ứng nhu cầu thử nghiệm phân tử của ngành bia là quy trình cần thiết để đơn giản hóa việc diễn giải dữ liệu. Việc sử dụng giải thích dữ liệu hoàn toàn dựa trên phần mềm làm tăng chi phí thiết bị và độ phức tạp của quy trình làm việc. Phí bảo trì hàng năm và hợp đồng dịch vụ cũng làm tăng thêm chi phí thiết bị vốn đã cao.

VERIFLOW® là duy nhất. Việc hiển thị kết quả trong VERIFLOW dựa trên công nghệ dòng chảy được đặt bên trong một cassette cầm tay. Sau khi đưa mẫu vào, liên hợp protein-vàng dạng keo được khử nước và phản ứng với khuếch đại được đánh dấu trong mẫu. Hỗn hợp này chảy dọc màng nitrocellulose được cố định bằng kháng thể bắt giữ trên vạch thử. Bộ khuếch đại, được kẹp giữa kháng thể liên hợp protein-vàng và kháng thể bắt giữ, tập hợp lại trên vạch thử nghiệm để tạo ra vạch màu đỏ thẫm có thể phát hiện được bằng mắt thường cho thấy sự hiện diện của ô nhiễm chỉ trong vòng 3 phút sau khi đưa mẫu vào. Màng này cũng chứa một vạch kiểm soát, sao cho một vạch duy nhất biểu thị kết quả âm tính và hai vạch biểu thị kết quả dương tính.

Để thu được kết quả định lượng, cường độ vạch thử có thể được đo bằng Đầu đọc VERIFLOW. Cassette phù hợp với giá đỡ của đầu đọc để đánh giá từng Cassette riêng lẻ. Một trong những yếu tố thách thức nhất trong việc đáp ứng nhu cầu thử nghiệm phân tử của ngành bia là quy trình cần thiết để đơn giản hóa việc diễn giải dữ liệu. Việc sử dụng giải thích dữ liệu hoàn toàn dựa trên phần mềm làm tăng chi phí thiết bị và độ phức tạp của quy trình làm việc. Phí bảo trì hàng năm và hợp đồng dịch vụ cũng làm tăng thêm chi phí thiết bị vốn đã cao. Đầu đọc được lập trình với một đường cong hiệu chuẩn để đo tỷ lệ của đường thử với cường độ của đường điều khiển và tương quan giá trị đó với đường cong hiệu chuẩn. Sử dụng thuật toán tích hợp này, đầu đọc hiển thị kết quả định lượng (tế bào/mL) từ dải thử nghiệm, tạo ra con số chính xác liên quan đến cường độ vạch thử nghiệm.

PHÁT TRIỂN VÀ XÁC THỰC DANH MỤC BIA

Bối cảnh về sự hỏng bia

Bia là đồ uống có độ pH thấp (3,8 – 4,7), chứa cồn (0,5 – 10% w/v) được công nhận là sản phẩm ổn định về mặt vi sinh. Việc thiếu chất dinh dưỡng và oxy (< 0,1 ppm), cùng với hàm lượng carbon dioxide cao (0/5 w/w) và tác dụng kháng khuẩn của axit đắng hoa bia (17 – 55 ppm axit iso-α), tạo ra môi trường không thuận lợi. môi trường cho vi sinh vật hư hỏng tồn tại và phát triển. Mặc dù các điều kiện dường như không tối ưu, các vi sinh vật gây hư hỏng bia vẫn vô tình xâm nhập vào bùn men, bể lên men, bể chứa và sản phẩm đóng gói. Kết quả là độ đục tăng lên và những mùi vị khó chịu trong bia. Mặc dù đóng gói vô trùng đối với bia đóng hộp và đóng chai, ô nhiễm sinh học có thể xảy ra sau đóng gói do quá trình thanh trùng hoặc lọc không hiệu quả dẫn đến ảnh hưởng xấu đến sản phẩm được đóng gói. Bia hư hỏng ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và có thể gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho nhà máy bia.

Danh mục xét nghiệm

INVISIBLE SENTINEL bắt đầu phát triển danh mục sản phẩm, được hỗ trợ bằng cách nhắm mục tiêu vào 6 danh mục sản phẩm làm hỏng bia hàng đầu (Bảng 1).

Mỗi xét nghiệm trong danh mục đều được phát triển có mục đích và được xác nhận rộng rãi để đáp ứng các tiêu chuẩn cao nhất về tính toàn diện, tính độc quyền và độ bền tổng thể. Bài viết này sẽ trình bày chi tiết về quá trình phát triển và xác nhận thử nghiệm đầu tiên và thử nghiệm dẫn đầu, BREWPAL. Tất cả các xét nghiệm đều tuân theo cùng một quy trình chất lượng cao để phát triển và xác nhận và được tóm tắt dưới đây

Phát triển khảo nghiệm

Vi khuẩn axit lactic (LAB) thuộc họ Lactobacillus BREWLAP® Vi khuẩn sản xuất axit lactic và chi Pediococcus gây ra khoảng 60 – 70% các vụ hư hỏng bia. Hai loại protein kháng hoa bia được gọi là horA và horC, đã được xác định là hợp chất gây hư hỏng gây ra hiện tượng đục và xốp, dẫn đến vị chua và mùi khó chịu trong bia.

Quá trình phát triển hệ thống xét nghiệm BREWPAL bao gồm một quy trình gồm ba giai đoạn mở rộng: thiết kế mồi, tối ưu hóa mồi và tối ưu hóa PCR.

Các gen kháng hoa bia horA và horC được xác định là các marker di truyền tạo ra Lactobacillus và Pediococcus spp, có khả năng làm hỏng bia. Sản phẩm gen của horA giúp kháng hoa bia với LAB bằng cách hoạt động như một chất vận chuyển đa thuốc, phụ thuộc ATP giúp loại bỏ axit đắng hoa bia ra khỏi tế bào trong khi horC mã hóa một chất vận chuyển đa thuốc, phụ thuộc vào lực, có động cơ proton. Trong một nghiên cứu toàn diện trên 50 sinh vật, người ta đã chứng minh rằng 94% Lactobacillus BREWBRUX® Brettanomyces bruxellensis và loài Pediococcus thử nghiệm có horA, trong khi 96% có horC. BREWPAL nhắm vào cả các gen kháng hoa bia, đặc hiệu của Lactobacillus và Pediococcus —đảm bảo 100% các loài được phát hiện và loại bỏ khả năng xảy ra kết quả âm tính giả.

Tổng cộng có 42 cặp mồi nguyên mẫu (20 mồi mục tiêu horA và 22 mồi mục tiêu horC) đã được phân tích trong một hệ thống ghép kênh để chọn ra các cặp ứng cử viên mồi hàng đầu trong đó các mục tiêu horA và horC được khuếch đại đồng thời.

Các nghiên cứu toàn diện và độc quyền đã được thực hiện để tối ưu hóa và xác nhận độ nhạy xét nghiệm của hệ thống. Tổng cộng có 21 chủng Lactobacillus và Pediococcus và 31 vi sinh vật có liên quan chặt chẽ được phân lập từ bia đã được sử dụng lần lượt cho các nghiên cứu bao gồm và độc quyền. Một bộ đầy đủ gồm 67 bảng độ nhạy đã được thực hiện để xác định giới hạn phát hiện (LOD) của xét nghiệm. Các nền mẫu đa dạng đã được thử nghiệm trong suốt quá trình phát triển, bao gồm bia nhạt và đậm, bia đặc biệt và bia có hương vị, nồng độ cồn cao và bia lên men nhiều lần cũng như các mẫu thu được ở các giai đoạn khác nhau của quá trình lên men. Trong quá trình phát triển và xác nhận nội bộ/bên ngoài, hơn 1300 cassette BREWPAL đã được chạy trên nhiều mẫu và các matrix khác nhau để đảm bảo đáp ứng các tiêu chí hiệu suất. Ngoài việc xác nhận nội bộ, hệ thống BREWPAL còn phải chịu các nghiên cứu xác nhận bên ngoài để kiểm tra độ nhạy, độ đặc hiệu và hiệu suất từ các mẫu của khách hàng. Dữ liệu được thu thập cho đến nay được trình bày chi tiết trong các phần sau.

Một nghiên cứu xác nhận nội bộ đã được tiến hành trước khi ra mắt BREWPAL® . Các mẫu bia từ ba nhà máy bia bao gồm các loại bia khác nhau đã được phân tích để xác định sự hiện diện của vi khuẩn Lactobacillus hoặc Pediococcus gây hư hỏng bằng xét nghiệm BREWPAL. Dữ liệu chứng minh tính bền vững và khả năng tương thích ma trận của hệ thống BREWPAL, cho phép phân tích nhiều loại sản phẩm bia.

Xác thực bên ngoài

Các thử nghiệm khác trong Danh mục Bia

Quy trình phát triển xét nghiệm cốt lõi cho từng bộ dụng cụ tương tự như quy trình của BREWPAL. Quá trình này bao gồm ba giai đoạn chính. Giai đoạn đầu tiên bao gồm thiết kế mồi, sau đó là sàng lọc các cặp mồi đó.

Sau đó, các mồi hàng đầu thể hiện khả năng khuếch đại mẫu mục tiêu có độ chính xác cao trong giai đoạn thứ hai của quy trình được phân tích trong các nền mẫu bia khác nhau với mức độ hoa bia và rượu khác nhau để đánh giá độ đặc hiệu và độ nhạy khi có mặt các hợp chất ức chế. Cuối cùng, nhiều bảng LOD (giới hạn phát hiện) đã được tiến hành trong bia để xác nhận độ nhạy của xét nghiệm, sau đó là các bảng bao gồm và độc quyền để đánh giá tính đặc hiệu của cấu hình bộ công cụ cuối cùng. Trong quá trình phát triển, hàng trăm cassette đã được chạy trên nhiều mẫu và matrix khác nhau để đảm bảo đáp ứng các tiêu chí về hiệu suất.

Danh mục bia VERIFLOW® được thiết kế để phát hiện trình tự DNA ribosome được bảo tồn từ nhiều loại bia hỏng như được liệt kê trong Bảng 6. Tất cả các xét nghiệm đều được thiết kế để có ngưỡng phát hiện là 10 tế bào/mL với thời gian quay vòng ba giờ ( ngoại trừ BREWSTAT yêu cầu bốn giờ). Toàn bộ danh mục có thể được sử dụng với nhiều loại bia, PCR khuẩn lạc và mẫu môi trường. Ngoài ra, một số thử nghiệm đã được xác nhận và có thể được sử dụng để phát hiện các loại nấm men gây hư hỏng. Ngoại trừ BREWDEK® và BREWSTAT, tất cả các thử nghiệm đều được thiết kế để tương thích với Đầu đọc quang để có kết quả định lượng.

BẢN TÓM TẮT

Ngành công nghiệp sản xuất bia đã phát triển theo cấp số nhân trong thập kỷ qua với những người mới tham gia tràn ngập thị trường. Do sự đa dạng của các phong cách bia và độ phức tạp trong quá trình sản xuất bia, quản lý chất lượng đã trở thành điểm khác biệt quan trọng hơn bao giờ hết. Nhu cầu về thông tin chính xác, hữu ích trong quá trình sản xuất và sau khi đóng gói là điều cần thiết để duy trì chất lượng và bảo vệ hình ảnh thương hiệu ngày nay.

Các phương pháp kiểm tra chất lượng truyền thống, nếu được thực hiện đúng cách, có thể xác định được vấn đề, nhưng chúng không thể thực hiện nhanh chóng và hiệu quả. Thông tin bị trì hoãn dẫn đến các quyết định về chất lượng mang tính phản ứng được đưa ra sau khi thiệt hại đã xảy ra. Ngoài ra, những công nghệ này thường yêu cầu quy trình làm việc rườm rà, tốn kém và phức tạp khi sử dụng. Ngoài ra, kết quả thử nghiệm có thể không rõ ràng về nguy cơ hư hỏng của một vi sinh vật cụ thể. Việc giải quyết các sinh vật gây hư hỏng trong thời gian thực là rất quan trọng để tránh ô nhiễm cơ sở, lưu giữ sản phẩm hoặc vận chuyển bia có nguy cơ.

Để giải quyết những thách thức này, INVISIBLE SENTINEL đã phát triển BREWPAL® và các xét nghiệm khác để cung cấp các xét nghiệm nhanh chóng, giá cả phải chăng và thân thiện với người dùng — mà không làm giảm độ nhạy, độ đặc hiệu hoặc độ chính xác. Việc phân tích các nền mẫu thử thách mà không cần tách chiết và/hoặc tinh chế DNA, chỉ có thể thực hiện được với VERIFLOW®, giúp giảm thời gian xử lý mẫu và chi phí vật liệu. BREWPAL và các sản phẩm bia hoàn chỉnh dựa trên VERIFLOW đã được các nhà máy bia hàng đầu trên thế giới áp dụng rộng rãi và công nghệ này đã nhanh chóng trở thành phương pháp hàng đầu trong ngành để thử nghiệm vi sinh vật. BREWPAL và danh mục sản phẩm hoàn chỉnh dựa trên VERIFLOW nhắm đến nhiều loại sinh vật khác nhau và có thể được sử dụng trong suốt quá trình sản xuất bia, trong thành phẩm và để thử nghiệm môi trường.

Nguồn:

Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp thiết bị kiểm soát vi sinh trong bia VERIFLOW™ hãng Invisible Sentinel (BioMérieux).