Giới thiệu

Sự chiếu sáng của mẫu vật là yếu tố quan trọng nhất để đạt được hình ảnh chất lượng cao trong kính hiển vi và kỹ thuật chụp ảnh hiển vi quan trọng hoặc hình ảnh kỹ thuật số. Chiếu sáng Kohler lần đầu tiên được giới thiệu vào năm 1893 bởi August Köhler của tập đoàn Carl Zeiss như một phương pháp cung cấp ánh sáng tối ưu cho mẫu vật. Các nhà sản xuất đã thiết kế kính hiển vi hiện đại sao cho thấu kính hội tụ và bất kỳ thành phần quang học nào khác được tích hợp vào chân đế của kính hiển vi sẽ chiếu được hình ảnh phóng to và hội tụ của dây tóc đèn lên mặt phẳng của màng chắn sáng của tụ quang được định vị đúng cách. Việc đóng hoặc mở màng chắn sáng của tụ quang điều khiển góc của các tia sáng đi ra khỏi tụ quang và chiếu tới mẫu vật từ tất cả các góc phương vị. Bởi vì nguồn sáng không hội tụ tại mẫu vật, nên ánh sáng ở đó về cơ bản là không hạt và mở rộng, đồng thời không bị giảm chất lượng do bụi và các lỗi trên bề mặt thủy tinh của thiết bị ngưng tụ. Việc mở và đóng màng chắn sáng của tụ quang phân áp điều khiển góc của hình nón ánh sáng chiếu tới mẫu vật. Cài đặt màng chắn sáng của tụ quang phân áp, cùng với khẩu độ của vật kính, sẽ xác định khẩu độ số của hệ thống kính hiển vi. Khi màng chắn tụ quang được mở ra, khẩu độ số của kính hiển vi tăng lên, dẫn đến khả năng phân giải và độ truyền ánh sáng lớn hơn. Các tia sáng song song đi qua và chiếu sáng mẫu vật được đưa đến hội tụ ở mặt phẳng tiêu điểm phía sau của vật kính, tại đó hình ảnh của màng chắn sáng của tụ quang biến đổi và hình ảnh của nguồn sáng sẽ được nhìn thấy rõ nét.

Cấu hình phù hợp của kính hiển vi liên quan đến chiếu sáng có thể là một trong những khái niệm bị hiểu sai nhiều nhất trong kính hiển vi quang học và là một thông số quan trọng phải được đáp ứng để đạt được hiệu suất tối ưu. Cường độ và phổ bước sóng của ánh sáng do nguồn chiếu sáng phát ra có tầm quan trọng lớn, nhưng điều quan trọng hơn nữa là ánh sáng phát ra từ các vị trí khác nhau trên dây tóc của đèn được thu thập và hội tụ tại mặt phẳng của màng chắn sáng của tụ quang. Trường liên hợp và các mặt phẳng khẩu độ quan trọng để thiết lập sự chiếu sáng thích hợp trong kính hiển vi được minh họa trong Hình 1. Trong phần này, các hướng dẫn được mô tả để thiết lập sự chiếu sáng Köhler (được sử dụng trong kính hiển vi huỳnh quang truyền ánh sáng phản xạ).

Các bước đầu tiên cần thiết để chuẩn bị cho chiếu sáng Köhler bao gồm các quy trình cơ bản cần thiết để quan sát mẫu vật trong điều kiện trường sáng. Đầu tiên, nếu tụ quang chứa các đĩa chặn hình khuyên, lăng kính tương phản giao thoa vi sai hoặc các bộ lọc khác, hãy xoay turret đến khẩu độ trường sáng, khẩu độ này sẽ mở và không chứa bộ lọc hoặc lăng kính. Thứ hai, chọn một mẫu vật phù hợp. Các mẫu vật tốt nhất bao gồm các mẫu trường sáng được nhuộm màu tốt, chẳng hạn như mô động vật hoặc thực vật rất mỏng (8 micromet trở xuống). Nếu không có sẵn một lam kính đã chuẩn bị sẵn, một phần nhỏ của màng film 35 milimét (chẳng hạn như film trong suốt hoặc âm bản) có kích thước khoảng 10 x 10 milimét có thể được dán vào tiêu bản kính hiển vi và làm phẳng bằng lam kính.

Các bước thiết lập Chiếu sáng Köhler

 

 

 

 

 

Các kính hiển vi phải được cấu hình phù hợp để quan sát các mẫu vật trong điều kiện chiếu sáng của Köhler, nhưng chỉ dành cho vật kính được sử dụng để đặt thiết bị. Khi một vật kính khác được xoay vào hệ thống quang học, bạn phải luôn điều chỉnh khẩu độ của tụ quang và màng chắn sáng để có các điều kiện chiếu sáng (về hiệu ứng, độ tương phản so với độ phân giải) tối ưu. Tuy nhiên, thường không cần thiết phải tháo thị kính mỗi khi sử dụng vật kính mới. Khi kích thước màng chắn sáng đã được đặt cho vật kính 10x, thường đủ để điều chỉnh kích thước cho các vật kính khác bằng cách trực quan hóa hình ảnh. Đầu tiên hãy mở khẩu độ cho đến khi đạt đến điểm dừng, sau đó đóng nó lại từ từ cho đến khi hình ảnh bắt đầu tối hơn một chút và độ tương phản đồng thời tăng lên.

Từ cuộc thảo luận ở trên, rõ ràng là màng chắn sáng của tụ quang nên được đặt giữa ánh sáng trực tiếp và ánh sáng lệch, phụ thuộc phần lớn vào các đặc tính hấp thụ, nhiễu xạ và khúc xạ của mẫu vật. Điều này phải được thực hiện mà không làm cho hình ảnh bị hỗn loạn. Lượng chi tiết hình ảnh và độ tương phản cần thiết để tạo ra máy chụp ảnh quang vi tốt nhất cũng phụ thuộc vào chỉ số khúc xạ, đặc điểm quang học và các thông số phụ thuộc vào mẫu vật khác.

Khi màng chắn sáng bị đóng quá xa, ánh sáng bị lệch bắt đầu khuất các tia chiếu sáng trực tiếp, dẫn đến hiện tượng nhiễu xạ gây ra các vân, dải và/hoặc hình thành hoa văn có thể nhìn thấy trong máy chụp ảnh quang học. Các vấn đề khác, chẳng hạn như hiện tượng khúc xạ, cũng có thể tạo ra các cấu trúc rõ ràng trong ảnh không có thật. Ngoài ra, việc mở màng chắn sáng tụ quang quá rộng sẽ gây ra hiện tượng lóa và tán xạ ánh sáng không mong muốn từ mẫu vật và các bề mặt quang học bên trong kính hiển vi. Điều này dẫn đến mất độ tương phản đáng kể và làm mất chi tiết hình ảnh. 

Hệ thống chiếu sáng của kính hiển vi, khi được điều chỉnh để chiếu sáng Köhler thích hợp, phải đáp ứng một số yêu cầu. Khu vực được chiếu sáng của mặt phẳng mẫu ít nhất phải lớn bằng trường quan sát đối với bất kỳ vật kính nào. Ngoài ra, ánh sáng phải có cường độ đồng đều và khẩu độ số phải thay đổi từ giá trị tối đa (bằng giá trị của vật kính) đến giá trị tối thiểu phụ thuộc vào đặc tính quang học của mẫu vật.

Nguồn: